摘要
以苯甲酸为内标，建立了HPLC测定动物血浆、尿、粪及心、肝、脾、肺、肾等组织匀浆中淫羊藿苷的浓度。
内容
淫羊藿苷(Icariin,ICA)是来源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿(Epimedium)植物的主要有效成分。国内已有报道用紫外分光光度法［1］、高效薄层扫描法［2］及用外标法定量的高效液相色谱法3，4］测定淫羊藿制剂中淫羊藿苷的含量。有关生物样品中淫羊藿苷浓度的测定方法国内外均未见报道，本文选择了苯甲酸作内标，建立了生物样品中淫羊藿苷高效液相色谱法，为进行淫羊藿苷的药物动力学研究提供了一个灵敏、可靠的检测手段。
1 仪器、试药和动物
日本岛津LC—6A高效液相色谱系统，SPD—6AV紫外检测器；SCL—6A系统控制器；SIL—6A自动进样器；CTO—6A恒温箱；CR—3A数据处理机。ICA对照品由沈阳药科大学植化教研室提供，纯度在99%以上；苯甲酸对照品由中国药品生物制品检定所提供；淫羊藿提取液(含ICA 5mg/mL)由沈阳药科大学药剂教研室提供。甲醇为色谱纯试剂，四氢呋喃、冰醋酸、乙酸乙酯均为分析纯试剂。动物为Wistar大鼠，雌雄兼用，体重282～316g，由沈阳药科大学动物室提供。2 色谱条件色谱柱：Zorbax ODS(10μm，4.6mm×250mm)；流动相：四氢呋喃—水—冰醋酸(20∶75∶5)；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：270nm；色谱柱柱温：35℃；检测灵敏度：0.02AUFS；纸速：2mm/min。3 生物样品的处理3.1 血浆 取样品0.1mL置10mL离心管中，加入乙酸乙酯3.5mL，振荡3min，离心(2000r/min,5min)，移取上清液，于50℃水浴用氮气吹干，残渣加内标液100μL，振荡溶解后进样20μL。3.2 粪和尿 大鼠粪便样品室温风干称重后，置乳钵内研成细末，用生理盐水按10%稀释使成混悬液。取混悬液0.5mL及尿样0.5mL用乙酸乙酯4.0mL提取2次，合并2次提取液，于50℃水浴用氮气吹干，加入甲醇1.0mL，振荡溶解后进样10μL。3.3 组织匀浆 将大鼠断头处死取心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、脑、睾丸各组织；称重，用组织匀浆器制成生理盐水匀浆，使每1mL含各组织0.4g，取此匀浆0.2mL，按血浆样品处理，进样分析。4 结果与讨论4.1 色谱行为 在上述色谱条件下，ICA与内标、淫羊藿提取液中的其它6种成分及血浆内源物质得到良好分离，ICA及内标保留时间分别为：7.92、11.93min。
4.2 标准曲线的制备 用甲醇精密配制成1mg/mL ICA标准贮备液，再用甲醇稀释成100μg/mL标准工作液，置冰箱保存。另用甲醇制成1mg/mL内标贮备液，再用甲醇稀释成40μg/mL标准工作液，置冰箱保存。用ICA标准工作液及空白生物样品配制标准系列，同各样品预处理操作，以ICA与IS峰高比为纵坐标，ICA浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。由于粪和尿中的代谢产物干扰内标色谱峰，因此粪和尿采用外标法，以ICA峰高为纵坐标，ICA浓度为横坐标绘制标准曲线。结果血浆、尿、组织匀浆和粪的线性范围分别为：1～128、2～32、2～32、4～64μg/mL。血浆的标准曲线方程(n=6)为：Y＝0.122X-0.0099 r＝0.9999其它生物样品标准曲线方程的r值均大于0.99。4.3 回收率分别于空白血浆中准确加入一定量的ICA标准工作液，按上述方法经提取后进行HPLC分析，按血浆标准曲线方程测得浓度，求出方法回收率。标准品经提取后，与标准品直接进样测定所得各对应标准品与内标峰高比值相比求得血浆样品的提取回收率，见表1。其它生物样品的方法回收率均大于95.26%，提取回收率均大于73.57%。
表1 血浆样品的回收率和精密度(n=5)
药物浓度
(μg/mL)
测定浓度
(μg/mL)
方法回收率
(±SD，%)
提取回收率
(±SD，%)
精密度RSD(%)
日内 日间
2
2.02±0.06
101.0±3.0
80.35±3.5
2.0
3.0
8
8.42±0.46
105.2±5.8
81.41±4.5
3.1
5.5
32
31.23±0.76
97.60±2.4
81.07±2.0
2.0
2.6
128
129.7±4.84
101.4±3.8
83.63±3.1
3.4
3.7
4.4 精密度 用空白血浆配制含ICA 2、8、32、128μg/mL样品每种浓度各5管测定日内及日间误差，结果见表1。其它生物样品的日内、日间相对标准偏差(RSD)均小于7.1%。4.5 灵敏度测定 按色谱峰信噪比(S/N)为3作为检测下限，结果显示ICA的最低检测浓度为0.5μg/mL。4.6 色谱分析条件选择 淫羊藿提取液中的主要化学成分为淫羊藿苷，还有其它黄酮类化合物存在，因此在上述色谱条件下可出现6～7个峰。为了获得最佳分离效果，首先用甲醇—水为流动相进行分离，当比例 为55∶45时，虽然ICA与其它化学成分已分离，但其保留时间较长，峰形较宽，且柱压较高。为此，选用对黄酮类化合物分离选择性较好的四氢呋喃，并加入一定量的冰醋酸，使弱酸化合物分离效果更佳。经过调整不同比例，多次试验，最后确定四氢呋喃—水—冰醋酸最佳配比为20∶75∶5。4.7 内标选择 为能用内标法准确测定ICA浓度，本文对槲皮素、芦丁、橙皮苷、氨茶碱、阿斯匹林、非那西丁、黄体酮、苯甲酸和兰萼甲素等13种药物进行了测定，考察其与ICA在血浆中的分离情况，结果用保留时间小于ICA的药物选作内标时，往往被血浆中干扰峰所干扰。阿斯匹林、非那西丁均在ICA前1～1.5min出峰，却被淫羊藿提取液中其它成分所干扰。兰萼甲素和苯甲酸均在ICA后2～4min出峰，没有任何峰的干扰，因此二者均可作为内标，考虑到苯甲酸方便易得，故认为选用苯甲酸作为内标更为适宜。4.8 提取溶媒的选择 本文考察了用乙醇、乙酸乙酸及乙醇—乙酸乙酯(1∶5)为溶媒对ICA进行提取测定，发现前者提取回收率小于60%，而后者虽然提取回收率大于95%，但带入杂质峰较多，而且色谱系统稳定性下降。因此实验选用乙酸乙酯为提取溶媒，各生物样品的提取回收率均大于73%，且方法稳定。4.9 药物在生物样品的稳定性 于空白各生物样品中加入ICA标准品，配制成15μg/mL浓度生物样品数份，置入-20℃冰箱保存，分别于第0、5、15、30d按实验方法测定， RSD均小于7.1%， 说明该药物在各生物样品中-20℃冰箱保存下，至少可稳定1个月。4.10 血药浓度的测定 为了检验上述方法是否能满足ICA的药代动力学研究，应用本方法进行了大鼠静脉注射淫羊藿提取液。由大鼠颈静脉按10mg/kg(含ICA)静脉注射，于给药后5、10、15、20、25、30、40、60、80、120、180min于颈静脉各取血0.25mL，肝素抗凝，离心后取血浆0.1mL按上述方法提取和测定ICA浓度，以给药时间为横坐标，血浆中ICA的对数浓度为纵坐标绘制药时曲线，见图2。血药浓度测定结果表明，本文建立的分析方法可满足ICA药代动力学研究的需要，具有灵敏度高，准确性好等优点。
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